Et mylder af liv

Teknologi Biodiversitet kan kortlægges med miljø-DNA. Men kan vi se en effekt af fx reduceret jordbehandling på jordbrugets biodiversitet? Det har forfatteren sat sig for at undersøge som en del af et større projekt.

Frøslev2202

For hvert prøveområde samles 81 jordprøver i en tønde for at opnå en repræsentativ prøve. Her indsamles prøver ved Alsted, Midtsjælland, 2018.

© Foto: Tobias Guldberg Frøslev
Momentum+

Bare et gram jord indeholder tusindvis af mikroskopiske organismer – bakterier, svampe, rundorme, protozoer. Indtil for nylig har det været meget besværligt bare at få et overfladisk kig ind i denne enorme diversitet.

Men med nye miljø-DNA-teknikker har man fået adgang til at studere en meget større del af biodiversiteten, heriblandt disse små organismer. Alle levende organismer indeholder DNA (det lange molekyle som indeholder arvematerialet/genomet), og alle efterlader de sig DNA-spor i miljøet, hvor de lever.

DNA som ekstraheres fra miljøprøver – vand, luft, jord – kaldes miljø-DNA. Naturovervågning, hvor biologer i gummistøvler med kikkert og lup om halsen registrerer dyr, planter og svampe i naturen, er de seneste år blevet suppleret med moderne DNA-metoder, hvor man eksempelvis ud fra en lille vandprøve kan se, hvilke dyr der lever i vandet.

Kort fortalt går metoden ud på, at man fokuserer på et DNA-område – et såkaldt markørgen – som har et niveau af variation, der egner sig til at adskille arter inden for den gruppe af organismer, som man ønsker at studere.

Nye metoder til DNA-sekvensering, hvor man kan producere umådeligt store mængder af data på kort tid og meget billigere end tidligere, har inden for ganske få år betydet, at mange biologiske forskningsområder er blomstret op, og helt nye forskningsfelter er opstået.

Således kan man fx nu undersøge, hvilke arter af fisk og hvaler der har svømmet i et område alene ved at studere DNA i en vandprøve. Man kan registrere, hvilke arter af natsværmere der findes i svært tilgængelige trækroner ved at kigge på DNA fra flagermuselort, og man kan sammenligne det ’biologiske fingeraftryk’ i jordresterne på en formodet voldtægtsforbryders cowboybukser med jord fra gerningsstedet.

Danske forskere har faktisk været pionerer inden for mange anvendelser af miljø-DNA i de ca. ti år, hvor forskningsfeltet har eksisteret.

Fra prøve til resultat

Vi har brugt miljø-DNA metoderne til at undersøge biodiversiteten i jord i flere danske forskningsstudier – eksempelvis i det store biodiversitetsprojekt ’Biowide’. I øjeblikket er vi ved at optimere metoderne til at hjælpe politiet med at opklare forbrydelser, hvor der er indsamlet biologiske spor i form af eksempelvis jord.

Metoderne med at sekvensere DNA fra jorden giver et meget dybere kig ind i biodiversiteten, end vi er vant til

Men vi er faktisk også i gang med at bruge metoden til at undersøge, om man kan se en effekt af Conservation Agriculture og reduceret jordbehandling på jordens biodiversitet. Altså om vi gennem at studere diversiteten og sammensætningen af DNA-rester i jord kan sige noget om forskelle og effekter af forskellig jordbrugspraksis.

Hvordan foregår dette miljø-DNA arbejde så? I forhold til ’bare’ at besøge en mark og observere og notere de arter man ser, så er processen med miljø-DNA meget længere, da den inkluderer flere ekstra trin i form af laboratoriearbejde og dataanalyse, før man overhovedet kan sige noget om, hvad jorden indeholder af liv.

Sammensætningen af arter i jord ændrer sig på en meget lille skala, således at to prøver taget med få centimeters afstand sagtens kan være meget forskellige. Derfor vil det oftest være alt for lidt at kigge på en enkelt jordprøve pr. område, da tilfældighedernes spil let vil dominere det billede, man ser. Som konsekvens vil man som oftest forsøge at få en slags gennemsnitligt billede af biodiversiteten ved at tage mange prøver.

I de fleste danske studier har man derfor brugt en metode, hvor man tager 81 separate jordprøver,  der bliver sammenblandet grundigt i en tønde, hvorefter en delprøve blev udtaget til analyse.

Denne homogeniserede delprøve vil have en bedre ’repræsentativitet’ end en enkelt prøve, da den i praksis er et gennemsnit af de 81 små-prøver. Sammenblandingen (homogeniseringen) af den ’puljede’ jordprøve foregår med en slags cementblander, og der blandes, indtil prøven ser ensartet ud.

DNA ekstraheres efterfølgende fra delprøven efter en standardiseret protokol. Derefter beslutter man sig for, hvilke organismegrupper man ønsker at undersøge – planter, svampe, pattedyr?

Et dybt kig ind i biodiversiteten

Der findes metoder til at få et meget bredt billede – med regnorme, svampe og planter osv. i samme omgang – men man betaler ofte med en lavere følsomhed og præcision. I praksis vil man derfor ofte køre separate målrettede analyser for henholdsvis svampe, bakterier, insekter osv.

For hver gruppe af organismer udfører man såkaldte pcr-reaktioner, som fokuserer og opformerer DNA’et på det markørgen for den organismegruppe, man ønsker at studere. Og efter nogle kvalitetstjek af pcr-produktet, bliver prøven derefter gjort klar til DNA-sekvensering.

De nye sekvenseringsplatforme producerer millioner af DNA-sekvenser, og hvis man udskrev data på almindeligt papir, ville man få mange hundrede meter høje papirstakke! Sekvensanalyserne (de bioinformatiske analyser) foregår derfor typisk på meget kraftige computere, der kan håndtere store datamængder. 

Frøslev2201

Meget af arbejdet med miljø-DNA foregår i laboratoriet, når man er kommet hjem med
sin jordprøve. Her er Ida Broman Nielsen i gang med at pipettere DNA-ekstrakter.

© Foto: Frederik Wolff, Statens Naturhistoriske Museum

I de bioinformatiske analyser omsætter man så at sige de ’rå’ sekvensdata til et format, man kan analysere på mere klassisk vis. Det vil i praksis være en tabel med, hvilke arter der er observeret hvor meget i hvilke prøveflader, og det vil som oftest have en størrelse, som gør, at man kan overskue og analysere det på en almindelig computer.

Hvis man arbejder med mikroorganismer (bakterier, svampe, protozoer, osv.) vil mange af de arter, man kan påvise med DNA i sådanne sekvenseringsanalyser, ikke kunne tildeles et formelt navn under de bioinformatiske analyser. Vi mangler nemlig at registrere og navngive hovedparten af jordens biodiversitet.

Her er specielt de små organismer overset – simpelthen fordi de er så små og svære at arbejde med, og mange af dem findes derfor ikke i DNA-referencedatabaserne.

Alligevel giver metoderne med at sekvensere DNA fra jorden et meget dybere kig ind i biodiversiteten, end vi er vant til. Og heldigvis udgør de unavngivne arter ikke noget større problem, hvis man skal undersøge forskelle i artsammensætning og andre generelle biodiversitetsmønstre.

Miljø-DNA er et ganske ungt ’set’ af metoder, som bliver bedre år for år, og sekvenseringsudgifterne bliver stadig lavere. Antallet af forskningsprojekter, der benytter sig af metoderne, er eksploderet, og det virker som om, kun fantasien sætter grænser for, hvilke miljøer og prøver man kan undersøge.

Selvom metoderne er relativt unge, så er de allerede så småt ved at finde indpas i den praktiske overvågning og registrering af naturen.

Miljø-DNA i Grønne Marker Stærke Rødder

I projektet ’Grønne Marker Stærke Rødder’ har vi anvendt disse nye metoder, og sekvenserne ligger i skrivende stund på computeren og venter på de sidste trin i analysen.

I projektet er der blevet indsamlet jordprøver fra 15 marker: 5 marker med Conservation Agriculture, 5 marker med reduceret jordbehandling og 5 marker, der drives konventionelt (almindeligt pløjet system) på Midtsjælland. 

Vi var ude at besøge markerne og indsamle jordprøver i løbet af efteråret 2018, og i hver mark har vi taget prøver fra midten af marken og langs en markkant, der støder op til naturlignende områder (levende hegn eller skov/plantage).

Frøslev2204

Undersøgelsen af miljø-DNA fra jord har været anvendt i flere danske forskningsprojekter. Her er Ida Bromann Nielsen ved at indsamle jord fra en skov i Nordsjælland i forbindelse med projektet DNAmark. 

© Susanna Santos

Småprøver fra hver af de 30 prøveområder er blevet taget med en ’tidselopgraver’, som udtager en pølse jord af ca. 5 cm diameter fra jordoverfladen og 15 cm ned.

Alle 81 småprøver (pr. prøveområde) er i marken blevet samlet direkte ned i en tønde, og hver småprøve er blevet taget med 4 meters mellemrum – enten i et stort kvadrat (markmidte) eller i et langt rektangel (markkant).

En lille delprøve af hver af de 30 puljede prøver er derefter blevet ført igennem laboratoriet med DNA-ekstraktion, DNA-opformering, sekvensering og til slut analyser af de fremkomne data, hvormed vi får nogle mål for diversiteten af protozoer, svampe, regnorme, rundorme og andre organismegrupper.

Som sagt er mange af disse organismer meget dårligt kendt og undersøgt, og vi forventer derfor ikke at kunne sætte navn og funktion på alt, hvad vi finder. Hvad vi derimod regner med er at kunne få et indblik i diversiteten af en del af jordens biodiversitet, som er meget vigtig for jordprocesserne, og som er meget svær at måle på andre måder.

Nogle af de spørgsmål, som vi ser frem til at kunne besvare med sekvenseringsdata fra de Midtsjællandske jorde, er:

  • Forårsager forskellige driftsformer forskelle i jordbundens sammensætning af organismer? Der vil selvfølgelig være forskel i artsammensætningen i de 30 undersøgte prøver, men kan vi se en systematisk forskel? Er der arter, som kun optræder eller er fraværende i den ene af driftsformerne? Måske kan vi forklare disse forskelle med vores viden om arternes levevis?
  • Hvilken driftsform giver plads til det største antal arter? Af nogle svært forklarlige tekniske årsager har det generelt været opfattelsen, at det vil være vanskeligt at få troværdige artsrigdomsmål vha. sekvensering. Men i vores tidligere projekter er det lykkedes at få rigdomsmål, som passede godt med vores forventninger og hypoteser. Så vi håber at kunne se, om der er systematisk flere (eller færre) arter i en af driftsformerne.
  • Hvilken driftsform rummer de mest unikke arter (sjældne arter)? Selvom et miljø indeholder flere arter end et andet miljø, så kan det være, at der er tale om trivielle arter, som findes overalt. Sådanne arter er i biodiversitetssammenhænge ikke lige så interessante som sjældne arter. Vi håber at kunne se, om en af driftsformerne indeholder en større eller mindre andel af unikke/sjældne arter.
  • Hvilken driftsform giver plads til flest af de store jordbundsdyr (regnorm, insekter)? Hvis man blot bruger sine øjne, så virker det som om, at jordbrug med mindre jordbehandling giver bedre mulighed for, at store arter kan leve i marken. Måske kan vi eftervise dette med sekvenseringsdata?
Frøslev2203

Efter indsamling af 81 jordprøver blandes disse sammen vha. en cementblander. Dette gøres for
at kunne udtage en repræsentativ delprøve til DNSa ekstraktion og sekvensering.

© Susanna Santos

Effektforstyrrelser og artssammensætning

Selvom dataanalysen stadig pågår, kan vi allerede nu se nogle tendenser i data, som det vil være værd at gå videre med i de mere detaljerede undersøgelser.

For de fleste af de undersøgte molekylære markører (svampe, bakterier, eukaryoter, regnorm, arthropoder) ser det ud som om, at der på den enkelte mark er en klar forskel på markmidte og markkant, hvor der er flere arter i markkanten.

Mest sandsynligt er det en simpel effekt af, at den tilstødende natur giver et lille, men ret tilfældigt bidrag af arter, som vi ikke observerede i midten af marken, men det skal undersøges nærmere.

Mere interessant er det, at det ser det ud til, at vi helt generelt kan se en systematisk effekt af forstyrrelsesgraden på artssammensætningen over hele paletten af molekylære markører, således at der er en systematisk ændring i artssammensætningen gående fra konventionel drift over reduceret jordbehandling til conservation agriculture.

Det er i skrivende stund uvist om de arter, der systematisk er hyppigere med mindre forstyrrelse, er arter som ’normalt’ ses i mere uforstyrrede naturlige habitater – som man måske kunne forvente. Så det er en af de ting, vi skal have undersøgt nærmere.

En anden ting, der er meget i iøjnefaldende, er, at vi i næsten udelukkende kan se DNA fra Stor Regnorm (Lumbricus terrestris) i conservation agriculture markerne, hvor den til gengæld udgør en stor del af den samlede mængde regnorme-DNA.